2003年,还在杭州艺校上学的叶祖新被选中出演《情断上海滩》而进入演艺圈。
2005年,参演古装电视剧《李小环与苗翠花》,饰演方世玉;同年,参演古装宫斗电视剧《大清后宫》,饰演少年道光帝。2006年参演家庭伦理电视剧《死去活来》,饰演樊涛;参演古装历史电视剧《皇上二大爷》,饰演赵金山。
2008年,参演战争历史电视剧《父亲的战争》,饰演彭龙。
2009年,参演古装历史电视剧《杨贵妃秘史》,饰演韦坚;同年参演家族斗争电视剧《大管家》,饰演李复修;参演战争历史电视剧《内线》,饰演苏子童。
2010年,参演古装历史电视剧《大唐女巡按》,饰演欧阳;参演电视剧《活佛济公2》,分饰必清、瘦仙童两角。
2011年,参演穿越电视剧《步步惊心》,饰演十爷;参演古装搞笑电视剧《怪侠欧阳德》,饰演淳贝勒。
2012年,参演爱情励志电视剧《错点鸳鸯》,饰演冷刚;参演电视剧《五台山抗日传奇之女尼排》,饰演任松良;参演古装历史电视剧《薛平贵与王宝钏》,饰演叶公公;参演战争历史电视剧《向着胜利前进》,饰演何医生;参演古装武侠电视剧《新白发魔女传》,饰演辛龙子;在古装历史传奇电视剧《隋唐英雄》中饰演裴元庆。
2014年,参演古装神话电视剧《欢天喜地俏冤家》,饰演高富帅;参演都市爱情电视剧《步步惊情》,饰演JACK;参演古装搞笑爱情电视剧《犀利仁师》,饰演范大同;参演都市爱情电视剧《说好的幸福》,饰演许诺;参演古装历史传奇电视剧《隋唐英雄4》,饰演薛丁山。
2015年,1月参演《蜀山战纪之剑侠传奇》,饰演医术不凡的张馅饼;8月参演的抗日电视剧《铁在烧》,饰演丁丑娃;9月主演的爱情喜剧电影《穷途》上映,饰演男主角邹孝宇;参演都市情感电视剧《爱情万万岁》,饰演金波;11月参演庄园爱情电视剧《我们的秘密》,饰演罗仁。
2016年,8月参演都市剧《一粒红尘》,饰演痴情的酒吧老板闵朗。12月,主演的青春励志偶像剧《食全食美》开机,饰演男主角打假卫士吴佑。
2017年3月31日,参演的悬疑电影《嫌疑人X的献身》在中国大陆上映,饰演破案的线索人物罗淼警官。