2003年，还在杭州艺校上学的叶祖新被选中出演《情断上海滩》而进入演艺圈。
2005年，参演古装电视剧《李小环与苗翠花》，饰演方世玉；同年，参演古装宫斗电视剧《大清后宫》，饰演少年道光帝。2006年参演家庭伦理电视剧《死去活来》，饰演樊涛；参演古装历史电视剧《皇上二大爷》，饰演赵金山。
2008年，参演战争历史电视剧《父亲的战争》，饰演彭龙。
2009年，参演古装历史电视剧《杨贵妃秘史》，饰演韦坚；同年参演家族斗争电视剧《大管家》，饰演李复修；参演战争历史电视剧《内线》，饰演苏子童。
2010年，参演古装历史电视剧《大唐女巡按》，饰演欧阳；参演电视剧《活佛济公2》，分饰必清、瘦仙童两角。
2011年，参演穿越电视剧《步步惊心》，饰演十爷；参演古装搞笑电视剧《怪侠欧阳德》，饰演淳贝勒。
2012年，参演爱情励志电视剧《错点鸳鸯》，饰演冷刚；参演电视剧《五台山抗日传奇之女尼排》，饰演任松良；参演古装历史电视剧《薛平贵与王宝钏》，饰演叶公公；参演战争历史电视剧《向着胜利前进》，饰演何医生；参演古装武侠电视剧《新白发魔女传》，饰演辛龙子；在古装历史传奇电视剧《隋唐英雄》中饰演裴元庆。
2014年，参演古装神话电视剧《欢天喜地俏冤家》，饰演高富帅；参演都市爱情电视剧《步步惊情》，饰演JACK；参演古装搞笑爱情电视剧《犀利仁师》，饰演范大同；参演都市爱情电视剧《说好的幸福》，饰演许诺；参演古装历史传奇电视剧《隋唐英雄4》，饰演薛丁山。
2015年，1月参演《蜀山战纪之剑侠传奇》，饰演医术不凡的张馅饼；8月参演的抗日电视剧《铁在烧》，饰演丁丑娃；9月主演的爱情喜剧电影《穷途》上映，饰演男主角邹孝宇；参演都市情感电视剧《爱情万万岁》，饰演金波；11月参演庄园爱情电视剧《我们的秘密》，饰演罗仁。
2016年，8月参演都市剧《一粒红尘》，饰演痴情的酒吧老板闵朗。12月，主演的青春励志偶像剧《食全食美》开机，饰演男主角打假卫士吴佑。
2017年3月31日，参演的悬疑电影《嫌疑人X的献身》在中国大陆上映，饰演破案的线索人物罗淼警官。
